細胞培養(yǎng)基作為生物制品生產(chǎn)的重要原材料之一,其質(zhì)量對生物制品有重要的影響。細胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)工藝和細胞培養(yǎng)基的原材料選用、生產(chǎn)過程及檢驗過程中的質(zhì)量控制對于細胞培養(yǎng)基的產(chǎn)品質(zhì)量具有直接影響。其中原材料的成份及其質(zhì)量直接決定了細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的質(zhì)量及安全性,選擇合適的物料是實現(xiàn)細胞培養(yǎng)基功能過程中需要解決的基礎問題。生產(chǎn)工藝的選擇(如原料的研碎、混合技術等)及生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制等直接影響產(chǎn)品的溶解性、批生產(chǎn)量及批次間差異,進而影響產(chǎn)品的質(zhì)量。
而細胞培養(yǎng)基的檢測項目為生物制品廠家控制原材料質(zhì)量提供一定的依據(jù),但是隨著生物制品安全性要求的提高,其所檢內(nèi)容還有待完善,就目前的檢測方法如下:
1. 澄清度檢查法
該方法依據(jù)中國藥典2010版二部附錄IX B 澄清度檢查法制定。澄清度是檢查藥品溶液的渾濁程度,即濁度,藥品溶液中如存在細微顆粒,當直射光通過溶液時,可產(chǎn)生光散射和光吸收的現(xiàn)象,致使溶液微顯渾濁,所以澄清度可在一定程度上反映藥品的質(zhì)量和生產(chǎn)工藝水平。水是培養(yǎng)基的溶劑,細胞培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份只有完全溶解于水才能被細胞吸收攝取,細胞才能生長增殖,因此培養(yǎng)基是否溶解以及培養(yǎng)液是否透明澄清直接影響培養(yǎng)基使用。通過對水溶解后的培養(yǎng)基的澄清度檢查,判斷細胞培養(yǎng)基的溶解性。此法是用規(guī)定級號的濁度標準溶液與供試品溶液比較,以判定細胞培養(yǎng)液的澄清度或其渾濁程度。
2. PH 值測定法
各種細胞的正常功能及一切生物化學反應,都是在適當和穩(wěn)定的酸堿環(huán)境下進行的,因此細胞培養(yǎng)基的pH值是細胞生長的重要參數(shù),pH值偏低或偏高都會影響細胞生長。該法依據(jù)中國藥典2010年版二部附錄Ⅵ H pH值的測定法進行。由于各酸度計的精度與操作方法有所不同,應嚴格按各儀器說明書與注意事項進行操作,并在使用之前注意校正。
在工業(yè)化使用時,由于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)基中含有pH指示劑如酚紅等,通常依據(jù)“眼睛”觀察培養(yǎng)液顏色來判定pH,或是簡單的使用pH試紙測定,但是上述方法存在較大的主觀因素,影響正確判定,并且在配制的過程中,不同區(qū)域還可能存在一定的水質(zhì)區(qū)別等,采用pH儀器檢測可以消除人的主觀因素,準確性高。此外,在檢測過程中,添加碳酸氫鈉后的培養(yǎng)基在測定的過程中,暴露在空氣中的時間也會對所測pH的準確性有一定的影響。
3. 干燥減量測定方法
細胞培養(yǎng)基具有吸濕性,在空氣中放置時水份會很快升高,干燥減量表示產(chǎn)品中的含濕量。細胞培養(yǎng)基是有菌制劑,其豐富的營養(yǎng)成份有利于微生物生長,保持培養(yǎng)基中的低水份含量可以防止微生物的繁殖。檢測細胞培養(yǎng)基中水份的含量采用的方法是干燥減量法。該測定方法是依據(jù)中國藥典2010年版二部附錄Ⅷ L 干燥失重測定法制定,具體是指產(chǎn)品在規(guī)定條件下干燥后所減失重量的百分率。減失的重量主要是水分、結晶水及其他揮發(fā)性物質(zhì)等。由減失的重量和取樣量計算供試品的干燥失重。
4. 滲透壓
通常動物細胞必須生活在等滲環(huán)境中,借助K+、Na+維持滲透平衡。雖然大多數(shù)細胞對滲透壓具有有一定的耐受性,但是培養(yǎng)液滲透壓過高容易使細胞脫水萎縮,培養(yǎng)液滲透壓過低容易使細胞膨脹破裂,控制培養(yǎng)基的滲透壓范圍對于細胞培養(yǎng)具有重要的作用。檢測通常采用冰點滲透壓儀進行,當供試品溶液的毫滲透壓摩爾濃度太大或大于儀器的測定范圍時,用適宜的溶劑稀釋至可測定的毫滲透壓摩爾濃度范圍。
5. 細菌內(nèi)毒素檢測方法
細菌內(nèi)毒素是許多病原性細菌所產(chǎn)生的毒素。細胞培養(yǎng)基中細菌內(nèi)毒素過高,對生物制品的質(zhì)量如純度、引起副反應等方面有影響,而且會降低生物制品的產(chǎn)率。
細菌內(nèi)毒素檢查法通常利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素,以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。其檢查包括凝膠法和光度測定法,后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時,可使用其中任何一種方法進行試驗。通常當測的結果有爭議時,以凝膠法結果為準。
6. 微生物限度
細胞培養(yǎng)基不是無菌產(chǎn)品,其中的微生物在一定條件下會吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)滋生繁殖,導致培養(yǎng)基變質(zhì)失效。控制細胞培養(yǎng)基中細菌和霉菌,是延長培養(yǎng)基有效期的方法之一,也是對生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品、原料、輔料、設備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生學評價的綜合依據(jù)之一,對其的檢測是非常必要的。檢測方法依據(jù)中國藥典2010年版附錄Ⅺ J 微生物限度檢查法進行,檢查項目為細菌數(shù)、霉菌數(shù)。
7. 細胞生長試驗
細胞在體外進行培養(yǎng)時,失去了機體的調(diào)節(jié)和控制作用,因此,細胞培養(yǎng)液除滿足細胞的營養(yǎng)要求外,還必須使其生存環(huán)境接近活體的環(huán)境。其中培養(yǎng)液及外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細胞的生長。細胞培養(yǎng)基的功能就是滿足細胞體外生長增殖需求,因此細胞培養(yǎng)效果的檢驗是產(chǎn)品質(zhì)量優(yōu)劣的一個直觀表述,是必檢項目,這也是一個產(chǎn)品性能特性表述的要求。
細胞培養(yǎng)檢測方法是:細胞在37℃恒溫條件下,在含體積分數(shù)為3%~10%小牛血清的細胞培養(yǎng)液中生長72h,觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù);細胞生長72h后,更換不含小牛血清的細胞培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48h,觀察細胞形態(tài)并進行細胞計數(shù)。培養(yǎng)過程中加血清培養(yǎng)主要檢測培養(yǎng)基的培養(yǎng)質(zhì)量,不加血清培養(yǎng)主要檢測培養(yǎng)基的有無毒害物質(zhì)。
細胞生長實驗不但在使用一個新的產(chǎn)品時是必須進行的檢測項目,在更換不同批次時,為檢測是否有批間差也必須進行;此外,即使是同一個批次,分次購買時,或是存放擱置較長時間再次使用時,也需進行該項目檢測,以防止培養(yǎng)基在貯存、運輸過程中可能發(fā)生的質(zhì)量變化。